ВИДІЛЕННЯ МАТРИКСНОЇ МЕТАЛОПРОТЕЇНАЗИ–2 З НЕТРАНСФОРМОВАНОЇ ТКАНИНИ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ ЖІНОК

Н. В. Мотрук

Анотація


Матриксна металопротеїназа-2 (ММП-2) – кальцій-залежна та цинквмісна позаклітинна протеїназа (КФ 3.4.24.24), яка бере активну участь у реорганізації позаклітинного матриксу при багатьох фізіологічних і патологічних процесах.

Мета дослідження – розробка методу виділення ММП-2 з нетрансформованої тканини молочної залози жінок.

            Для отримання ММП-2 з тканини молочної залози була використана модифікована методика Cawston and Tyler (1979). Модифікація полягала в поетапному осадженні (NH4)2SO4 і використанні іонів Zn2+ і Са2+ для активації та стабілізації активності ферменту.

            Відбір анатомічного матеріалу для досліджень проводили з дотриманням етичних і правових норм. Гомогенати досліджуваних тканин діалізували проти дистильованої води без солей, а також з 2,0 мМ розчинами ZnCl2, CaCl2 або їх суміші. Діалізати піддавали поетапному фракціонуванню (осадження при 20, 40, 60 та 80 %-му насиченні) (NH4)2SO4 з подальшим центрифугуванням при 9000g впродовж 45 хв. Для видалення надлишку (NH4)2SO4 фракції піддавали повторному діалізу у тих же умовах. Активність ММП-2 визначали за гідролізом 0,001 % розчину желатини, вміст білку – методом Лоурі.

            Максимальна питома активність ММП-2 встановлена у фракції, отриманої при 60 %-му насиченні (NH4)2SO4 у присутності суміші іонів Zn2+ і Са2+. Найбільша очистка ММП-2 (у 231,77 рази) і максимальний відсоток виходу ферменту (349,41 %) отримані у фракції 60 %-го насичення (NH4)2SO4 у присутності іонів Са2+. Значне збільшення коефіцієнта очистки під час фракціонування (NH4)2SO4 у присутності іонів Zn2+ і Са2+ свідчить про необхідність додавання цих іонів для активації і стабілізації структури ферменту.

            Результати проведених досліджень свідчать про те, що поетапне осадження сульфатом амонію призводить до фракціонування ММП-2 нетрансформованої тканини молочної залози жінок переважно при 60 %–80 %-му насиченні (NH4)2SO4 (85,0 % усієї активності). Наявність протеїназної активності у фракціях, отриманих при інших насиченнях (NH4)2SO4, що складає 15,0 % сумарної активності ферменту, свідчить, найімовірніше, про наявність множинних форм ММП-2.


Ключові слова


Матриксна металопротеїназа-2 (ММП-2) – кальцій-залежна та цинквмісна позаклітинна протеїназа (КФ 3.4.24.24), яка бере активну участь у реорганізації позаклітинного матриксу при багатьох фізіологічних і патологічних процесах. Мета дослідження – розробка ме

Повний текст:

PDF (Русский)

Посилання


Vinogradova RP (1978) Molecular mechanisms action of enzymes [Molekulyarnyie mekhanizmy deystviya fermentov], Kiev: Vyshcha shkola, 280 p.

The World Health Organization. Proceedings of the annual reports [Vsemirnaya Organizaciya Zdravokhraneniya. Materialy ezhegodnykh otchetov], Sankt-Peterburg, 1981, 286 p.

Glantz S (1998) Biomedical Statistics [Mediko - biologicheskaya statistika], Moskva: Praktika, 495 p.

Dixon M, Webb E (1966) Enzymes [Fermenty], Moskva: Мir, 816 p.

Kochetov GA (1971) Practical handbook of enzymology [Prakticheskoye rukovodstvo po enzimologii], Moskva: Vysshaya shkola, 352 p.

Lutsenko SV, Kiselev SM, Severin SE (2003) “Molecular mechanisms of tumor angiogenesis” [“Molekulyarnye mekhanizmy angiogeneza opukholi”], Biochemistry J, № 68, 3, pp 349 – 365.

Vovchuk I L Sposib vyznachennya aktyvnosti matryksnoi metaloproteinazy-2 [The method of determination of activity matrix metalloproteinase-2]. Patent № u 2009 08087, Ukraine, 2009.

Plakunov VK (2001) Foundation of enzymology [Osnovy enzimologii], Moskva: Logos, 128 p.

Practical chemistry of albumen: Per. s angl. In editor Darbre A [Prakticheskaya khimiya belka] Moskva: Мir, 1989, 623 p.

Scoups R (1985) Protein purification methods [Metody ochistki belkov], Moskva: Мir, 358 p.

Khasigov Z P, Podobed OV, Ktsoeva SA (2001) “Matrix metalloproteinase of normal human tissues” [“Metalloproteinazy matriksa normalnykh tkaney cheloveka”], Biochemistry J, № 66, 2, pp 167 – 179.

Cawston TE, Tyler JA (1979) “Purification of pig synovial collagenase to high specific activity”, Biochem J, № 183, 3, pp 647 – 656.

Das S, Mandal M, Mandal A (2003) “Identification, purification and partial characterization of tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2 in bovine pulmonary artery smooth muscle”, Mol Cell Biochem, № 254, 1-2, pp 275 – 287.

Díaz N, Suarez D (2007) “Molecular dynamics simulations of matrix metalloproteinase 2: role of the structural metal ions”, Biochemistry J, № 46, 31, pp 8943 – 8952.

Hipps DS, Hembry RM, Docherty AJ (1991) “Purification and characterization of human 72-kDa gelatinase (type IV collagenase). Use of immunolocalisation to demonstrate the non-coordinate regulation of the 72-kDa and 95-kDa gelatinases by human fibroblasts”, Chem Hoppe Seyler, № 372, 4, pp 287 – 296.

Kandalam V, Basu R, Abraham T (2010) “TIMP-2 deficiency accelerates adverse post-myocardial infarction remodeling because of enhanced MT1 -MMP activity despite lack of MMP2 activation”, Circ. Res, № 106, 4, pp 796 – 808.

Kanomata N (2005) “Expression and localization of mRNAs for matrix

metalloproteinases and their inhibitors in mixed bronchioloalveolar carcinomas with invasive components”, Modern. Pathology, № 18, pp 828–837.

Lowry O H, Rosenbrough N I, Fan A Z, Randol R J (1951) “Protein measurement with the Folin-Phenol reagent”, J Biol Chem, № 194, 1, pp 265 – 271.

Murphy G, McAlpine CG, Poll CT, Reynolds JJ (1985) “Purification and characterization of a bone metalloproteinase that degrades gelatin and types IV and V collagen”, Biochim Biophys Acta, № 831, 1, pp 49 – 58.

Murphy G, Reynolds JJ, Bretz U, Baggiolini M (1982) “Partial purification of collagenase and gelatinase from human polymorphonuclear leucocytes. Analysis of their actions on soluble and insoluble collagens”, Biochem J, № 203, 1, pp 209 – 221.

Nagase H, Visse R, Murphy G (2006) “Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs”, Cardiovasc. Res, № 69, 3, pp 562 – 573.

Okada Y, Morodomi T, Enghild JJ (1990) “Matrix metalloproteinase 2 from human rheumatoid synovial fibroblasts. Purification and activation of the precursor and enzymic properties” , Eur J Biochem, № 194, 3, pp 721 – 730.


Пристатейна бібліографія ГОСТ


Виноградова Р. П.  Молекулярные механизмы действия ферментов / Р. П. Виноградова. – Киев: Вища школа, 1978. – 280 с.

 

Всемирная Организация Здравохранения / Материалы ежегодных отчетов. – Санкт-Петербург. 1981. – 286 с.

 

Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. / С. Гланц. – М.: Практика, 1998. – 495 с.

 

Диксон М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб. – М: Мир, 1966. – 816 c.

Кочетов Г. А. Практическое руководство по энзимологии / Г. А. Кочетов – М.: Высшая школа, 1971. – 352 с.

 

Луценко С. В. Молекулярные механизмы опухолевого ангиогенеза / С. В. Луценко, С. М. Кисилев, С. Е. Северин. – Биохимия. – 2003. – T. 68. – № 3. – С. 349 – 365.

 

Патент на корисну модель № 46633 Україна, МПК (2009), C12N 9/50, C12N 9/64. Спосіб визначення активності матриксної металопротеїнази-2 / І. Л. Вовчук;  заявник та патентодержатель Вовчук І. Л. - № u 2009 08087; заявл. 31.07.2009; опубл. 25.12.2009, Бюл. № 24.

 

Плакунов В. К. Основы энзимологии / В. К. Плакунов.  – М.: Логос, 2001. – 128 с. 

 

Практическая химия белка: Пер с англ. [ Под ред.  А. Дабре]. – М.: Мир, 1989. – 623 с.

 

Скоупс Р. Методы очистки белков: Пер с англ. / Р. Скоупс. – М.: Мир, 1985. – 358 с.

 

Хасигов З. П. Металлопротеиназы матрикса нормальных тканей человека / З. П. Хасигов, О. В. Подобед, С. А. Кцоева  [и  др.]  // Биохимия. –2001. – T. 66. – № 2. – С. 167–179.

 

Cawston T. E. Purification of pig synovial collagenase to high specific activity / T. E. Cawston,  J. A Tyler //  Biochem J. –  1979. – V. 183, № 3. – P. 647–656.

 

Das S. Identification, purification and partial characterization of tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2 in bovine pulmonary artery smooth muscle / S. Das, M. Mandal, A. Mandal [et al] // Mol. Cell. Biochem. – 2003. – V. 254, № 1–2. – Р. 275–287.

 

Díaz N. Molecular dynamics simulations of matrix metalloproteinase 2: role of the structural metal ions / N. Díaz, D. Suarez // Biochemistry. – 2007.  – V. 46, № 31. – Р. 8943–8952. 

 

Hipps D. S. Purification and characterization of human 72-kDa gelatinase (type IV collagenase). Use of immunolocalisation to demonstrate the non-coordinate regulation of the 72-kDa and 95-kDa gelatinases by human fibroblasts / D. S. Hipps, R. M. Hembry, A. J. Docherty [et al] // Chem. Hoppe. Seyler. – 1991. – V. 372, № 4. – Р. 287–296.

 

Kandalam V. TIMP-2  deficiency accelerates adverse post-myocardial infarction  remodeling  because of enhanced MT1 -MMP activity despite lack of  MMP2 activation / V. Kandalam,  R. Basu, T. Abraham [et al] // Circ. Res. – 2010. – Vol. 106, № 4. – Р. 796–808.

 

Kanomata N. Expression and localization of mRNAs for matrix metalloproteinases and their inhibitors in mixed bronchioloalveolar carcinomas with invasive components / N. Kanomata // Modern Pathology. – 2005. – № 18. – Р. 828–837.

 

Lowry O.H. Protein measurement with the Folin-Phenol reagent / O. H. Lowry, N. I. Rosenbrough, A. Z. Fan, R. J. Randol // J. Biol. Chem. – 1951. – V. 194, № 1. – P. 265–271.

 

Murphy G. Purification and characterization of a bone metalloproteinase that degrades gelatin and types IV and V collagen / G. Murphy, C. G. McAlpine, C. T. Poll,  J. J. Reynolds //  Biochim. Biophys. Acta.  –1985. – V. 831, № 1. – Р. 49–58.

 

Murphy G. Partial purification of collagenase and gelatinase from human polymorphonuclear leucocytes. Analysis of their actions on soluble and insoluble collagens / G. Murphy,  J. J. Reynolds, U. Bretz,  MBaggiolini // Biochem J. – 1982. – V. 203, № 1. – Р. 209–221.

 

Nagase H. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs / H. Nagase,  R. Visse, G. Murphy // Cardiovasc. Res. – 2006. – V. 69, № 3. – Р. 562–573.

 

Okada Y. Matrix metalloproteinase 2 from human rheumatoid synovial fibroblasts. Purification and activation of the precursor and enzymic properties / Y. Okada, T. Morodomi, J. J. Enghild [et al] // Eur. J. Biochem. – 1990. – V. 194, № 3. – Р. 721–730. 

 





DOI: https://doi.org/10.18524/2077-1746.2016.1(38).72064

Посилання

  • Поки немає зовнішніх посилань.